Лаборатория иммунохимии

Зав. лабораторией д.х.н., профессор Сергей Юрьевич ЩеголевЗав. лабораторией д.х.н., профессор Сергей Юрьевич ЩеголевЛаборатория иммунохимии (ЛИ) была организована в 1984 году. До 2003 года в ее состав входили группа иммунохимических и радиоизотопных методов анализа (рук. д.б.н., профессор Л.Ю. Матора), группа иммунотехнологии (рук. д.б.н. Л.А. Дыкман), группа физической химии биополимеров (рук. к.б.н. Н.В. Евсеева) и группа биофизики (рук. д.ф.-м.н., профессор Н.Г. Хлебцов). С апреля 2003 года группа биофизики была преобразована в самостоятельное структурное подразделение, ныне носящее название «Лаборатория нанобиотехнологии». За время существования ЛИ ее сотрудниками защищены 14 кандидатских и 6 докторских диссертаций.

В настоящее время в ЛИ работают 12 сотрудников, в том числе 4 доктора и 6 кандидатов наук. Двое сотрудников имеют ученое звание профессора. Сотрудники лаборатории принимают активное участие в работе Учебно-научного центра физико-химической биологии Саратовского госуниверситета (СГУ) при ИБФРМ РАН в качестве лекторов, руководителей курсовых и дипломных работ студентов, руководят работами аспирантов ИБФРМ РАН и СГУ, осуществляют научное консультирование работ соискателей научных степеней и докторантов.

Л.Ю. Матора, д.б.н., профессорЛ.Ю. Матора, д.б.н., профессор Л.А. Дыкман, д.б.н.Л.А. Дыкман, д.б.н. С.А. Староверов, д.б.н.С.А. Староверов, д.б.н. Н.В. Евсеева, к.б.н.Н.В. Евсеева, к.б.н. Г.Л. Бурыгин, к.б.н.Г.Л. Бурыгин, к.б.н.

А.А. Широков, к.х.н.А.А. Широков, к.х.н. А.И. Красов, к.б.н.А.И. Красов, к.б.н. А.М. Буров, к.х.н.А.М. Буров, к.х.н. А.С. Фомин, к.б.н.А.С. Фомин, к.б.н. А.А. ГолубевА.А. Голубев


Главной целью проводимых исследований является получение новых сведений о молекулярных и клеточных механизмах взаимодействий партнеров в эктосимбиотических растительно-микробных системах с развитием технологий иммуноанализа и тестов, характеризующих ответные реакции растений во взаимоотношениях с почвенной микрофлорой, методов получения антител к широкому спектру полноценных антигенов и гаптенов на основе нанотехнологических и биоинженерных подходов.

Растительно-микробные симбиозы составляют одну из фундаментальных основ эволюции жизни на Земле и используются в развитии современных биотехнологий повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и улучшения плодородия почв, очистки объектов окружающей среды от разнообразных загрязнений, получения ценных биологически активных веществ и т.п.

Основные направления исследований:
Анализ строения поверхностных антигенов бактерий рода Azospirillum и оценка вклада этих структур в формирование ответных реакций растений при бактериальной колонизации.
Изучение взаимодействий целых растений (in vivo), а также растительных клеток, тканей и органов in vitro с ассоциативными стимулирующими рост растений бактериями и изолированными с их поверхности макромолекулами.
– Изучение молекулярных и клеточных механизмов иммуностимулирующего действия наночастиц золота при их использовании в качестве носителя и адъюванта для получения антител in vivo к широкому спектру высоко- и низкомолекулярных антигенов; развитие технологии фагового дисплея для получения мини-антител in vitro.


Наиболее значимые результаты

Описан принципиально новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленный перераспределением вкладов двух разных (полноценных) О-специфических полисахаридов в архитектуру клеточной поверхности бактерий в зависимости от возраста культур.

Создана биотест-система серологической идентификации почвенных ассоциативных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их углеводных и белковых антигенов. По результатам применения комплекса иммунохимических методов с учетом сходства и различий серологических свойств О-антигенов проведено серотипирование 73-х коллекционных штаммов 7 видов азоспирилл (в том числе, выделенных из почв Саратовской области), разделенных на 4 серогруппы и 37 серовариантов. Серологическая классификация азоспирилл имеет большое значение для экологических исследований, анализа распространенности бактерий в почве и прогнозирования активности бактериальных штаммов во взаимодействии в макропартнерами.

Получены сведения о химическом строении иммунодоминантных участков липополисахаридов (ЛПС) модельных штаммов Azospirillum brasilense. Установлены вклады O- и H-антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл, оценено влияние плазмидного состава на ее антигенные свойства (совместно с лабораторией генетики микроорганизмов – ЛГМ ИБФРМ РАН).

В составе флагеллина полярного жгутика 22 штаммов азоспирилл выявлено наличие углеводных фрагментов, что существенно расширяет круг примеров данной посттрансляционной модификации флагеллина у Azospirillum. Совместно с сотрудниками лаборатории химии углеводов ИОХ РАН выделены и исследованы углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7. Впервые для бактерий в составе флагеллина полярного жгутика установлено наличие О-связанного полисахарида с молекулярной массой 7,7 кДа, определено химическое строение его повторяющегося тетрасахаридного звена.

Повторяющееся звено О-связанного гликана флагеллина A. brasilense Sp7Повторяющееся звено О-связанного гликана флагеллина A. brasilense Sp7

Обнаружена иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина одному из О-специфических полисахаридов соматического антигена данного штамма. С учетом полученных результатов, свидетельствующих об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисахаридов, экзополисахаридов и ЛПС азоспирилл, это позволяет предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещивающихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода Azospirillum.

Заселение корневых волосков пшеницы азоспириллами (иммунофлуоресцентный анализ)Заселение корневых волосков пшеницы азоспириллами (иммунофлуоресцентный анализ)С использованием антител, специфичных к различным биомолекулам, экспонированным на наружной мембране A. brasilense, качественно и количественно охарактеризован вклад полисахаридных и белковых антигенов в реализацию разных типов коллективной подвижности азоспирилл (совместно с сотрудниками ЛГМ ИБФРМ РАН). Таких как образование бактериальных биопленок на границе раздела фаз, роение и коллективная миграция с образованием микроколоний. Полученные результаты свидетельствуют, в частности, о том, что заселение корневых волосков пшеницы азоспириллами происходит преимущественно по механизму распространения с образованием микроколоний.

Линейный иммуноэлектрофорез белковых антигенов наружной мембраны дикого штамма A. brasilense Sp245 (1) и его Gri+ мутанта (2) с родоспецифичными антителами (А) на белковые детерминантыЛинейный иммуноэлектрофорез белковых антигенов наружной мембраны дикого штамма A. brasilense Sp245 (1) и его Gri+ мутанта (2) с родоспецифичными антителами (А) на белковые детерминантыМетодом иммуноэлектронной микроскопии осуществлена визуализация поверхностных родоспецифичных белковых антигенов A. brasilense. На поверхности мутантного штамма A. brasilense SK048 (распространяющегося с образованием микроколоний и имеющего так называемый Gri+-фенотип) были выявлены структуры – предположительно пили, которые могут быть вовлечены в процесс его микроколониального распространения.

Впервые показано, что инокуляция ассоциативными бактериями рода Azospirillum микроклонов картофеля в культуре позволяет повысить эффективность технологии производства посадочного материала картофеля с улучшением приживаемости микрорастений в условиях открытого грунта и увеличением урожайности клубней. На этой основе отработан способ создания активного растительно-микробного симбиоза in vitro.

Показано, что присутствие ЛПС штамма A. brasilense Sp245 в среде культивирования стимулирует процессы вторичной дифференциации и регенерационную способность каллусных клеток пшеницы, повышая тем самым эффективность культивирования in vitro генотипов с низким эмбриогенным потенциалом. Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности его повышения с использованием ЛПС ассоциативных бактерий.

Ассоциация рост-стимулирующих ризобактерий Azospirillum с растениями, созданная in vitro (a), существенно улучшает технологию микроклонального размножения (a, b) и повышает урожай картофеля (c, d)Ассоциация рост-стимулирующих ризобактерий Azospirillum с растениями, созданная in vitro (a), существенно улучшает технологию микроклонального размножения (a, b) и повышает урожай картофеля (c, d)


Результаты сравнительного ИФА образцов почв Саратовской области с использованием антител на ЛПС Sp245 (светло-серая область) и на ЛПС Sp7 (темно-серая область)Результаты сравнительного ИФА образцов почв Саратовской области с использованием антител на ЛПС Sp245 (светло-серая область) и на ЛПС Sp7 (темно-серая область)Впервые предложен вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) микроосадков почвенных суспензий с использованием антител на ЛПС азоспирилл, позволяющий проводить выявление соматического бактериального антигена в почве. На основе оптимизированного варианта ИФА исследована динамика выявления in situ соматического антигена интродуцированных в почву ассоциативных бактерий A. brasilense. Полученные результаты показали существенное влияние растений (пшеницы сорта Саратовская 29) на уровень развития бактерий данного рода в почве и зависимость численности экзогенной бактериальной популяции, оцениваемой по уровню обнаруженного ЛПС, от агротехнических воздействий на почву. Оценка распространенности азоспирилл в различных почвах, проведенная данным методом, впервые выявила значительный вклад серотипа Sp245 в сравнении с серотипом Sp7 среди азоспирилл,представленных в микробоценозе почв Саратовской области. Данные по выживаемости азоспирилл, интродуцированных в почву и прикорневую зону растений, характеризуют их как жизнеспособный инокулянт, существование которого в почве в переживающей форме может длиться десятки суток.

Москва, издательство Наука, 2008 год, 319 стрМосква, издательство Наука, 2008 год, 319 стрВидное место в развитии методологии иммунохимических исследований в ЛИ занимает изучение уникальных физико-химических и биохимических свойств наночастиц золота и их биоконъюгатов. Данные работы были начаты с середины 1980-х годов в совместных исследованиях сотрудников ЛИ и (в то время) лаборатории биофизических методов исследования задолго до обнародования в 2001 году Нанотехнологической инициативы как национального проекта США и последующего признания нанотехнологий в качестве одного из приоритетных направлений развития российской науки. В настоящее время они ведутся в тесном взаимодействии с сотрудниками лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (см. выше).

В этих исследованиях были оптимизированы методики получения конъюгатов разнообразных биоспецифических зондов с наночастицами коллоидного золота (КЗ) различных размеров и форм (наносферы, наностержни, нанооболочки, наноклетки, нанозвезды). С их использованием впервые в отечественной практике было обеспечено получение маркеров в широком спектре биоспецифических зондов и размеров частиц КЗ для электронной микроскопии, для твердофазного био- и иммуноанализа, иммунохроматографии и т.п. Были созданы условия для производства опытных партий золотосодержащих биоспецифических маркеров, используемых в исследованиях по биохимии, биотехнологии, медицине, ветеринарии и т.п. Полученные результаты иллюстрируют эффективность КЗ в качестве инструмента для анализа бактериальных и растительных клеточных структур, оценки относительной гидрофобности бактериальной поверхности, диагностики ряда инфекционных заболеваний животных и человека и др.

С применением КЗ в качестве носителя антигенов и адъюванта (in vivo) и методафагового дисплея (in vitro) развиты процедуры получения антител к разнообразным антигенам и гаптенам. Получены приоритетные данные, позволяющие судить о возможных иммунологических механизмах впервые обнаруженного адъювантного действия наночастиц золота, одного из 12 самых удивительных свойств золотых гидрозолей по мнению австралийских ученых, отраженному обзоре Brown C.L. et al. Colloidal metallic gold is not bio-inert // Inflammopharmacology. – 2008. – Vol. 16. – P. 133–137. Методом фагового дисплея наработаны мини-антитела к целым животным и бактериальным клеткам, использованные для их выявления и исследования в иммунохимических тестах.

Предложен вариант иммуноанализа на частицах золя с использованием микротитровальных планшетов и ИФА-ридера, позволяющий существенно сократить время анализа при большем количестве исследуемых проб и большей чувствительности метода. Разработан новый метод быстрого и чувствительного количественного определения белков с применением конъюгатов протеолитических ферментов с КЗ.

Впервые получены оценки информативности метода ИК-Фурье спектроскопии сухих пленок золотых биоконъюгатов (совместно с сотрудниками лаборатории биохимии ИБФРМ РАН) для высокочувствительного определения взаимодействия белковых молекул с поверхностью золотых наночастиц, что может послужить новым эффективным средством регистрации биоспецифических реакций типа антиген-антитело, фермент-субстрат, лектин-углевод и т.п. Обнаружены изменения спектров для биомолекул, инкубированных с золотыми наночастицами, являющиеся доказательством адсорбции этих молекул на частицах КЗ, что особенно важно с точки зрения проблем контроля синтеза конъюгатов КЗ с разнообразными гаптенами.

Разработан метод получения конъюгатов фаговых мини-антител с КЗ, который может быть использован при создании тест-систем с использованием твердофазных методов (дот-блот анализ, иммунохроматография), а также в электронно-микроскопических исследованиях.

Мультиплексный дот-анализ с наноклетками кроличьих антител на IgG цыпленка (А2,Б3,В1,Г4,Д3,Д4), IgG крысы (А1,Б2,В4,Г3,Д2), аффинно очищенной фракции антител на IgG мыши (А3,Б1,В2,Г1) и БСА (А4,Б4,В3,Г2,Д1)Мультиплексный дот-анализ с наноклетками кроличьих антител на IgG цыпленка (А2,Б3,В1,Г4,Д3,Д4), IgG крысы (А1,Б2,В4,Г3,Д2), аффинно очищенной фракции антител на IgG мыши (А3,Б1,В2,Г1) и БСА (А4,Б4,В3,Г2,Д1)Установлено, что разработанная впервые процедура иммуноаффинной очистки кроличьих антимышиных антител позволяет выделить их фракцию, реагирующую исключительно с детерминантами IgG мыши. Сложность получения высокоспецифичных вторичных антител на иммуноглобулины мыши и крысы обусловлена тем, что исходные антитела этих грызунов имеют антигенные перекрёсты, вызванные наличием в их структуре общих антигенных детерминант. Эффективность полученных in vivo высокоселективных антител к иммуноглобулинам мыши и крысы продемонстрирована в мультиплексном дот-анализе с золотосеребряными наноклетками. Подобранные параметры наноклеток обеспечили окраску в разные цвета мест связывания полученных высокоспецифичных антител с разными мишенями (куриными, крысиными и мышиными IgG).

Установлено, что золотые наночастицы и их конъюгаты с низко- и высокомолекулярными антигенами стимулируют дыхательную активность клеток ретикулоэндотелиальной системы и активность митохондриальных ферментов макрофагов и (в ряде случаев) продукцию провоспалительных цитокинов. Это может быть одним из существенных факторов, определяющих обнаруженные нами адъювантные свойства КЗ. Последние создают, в частности, основу для его применения при производстве вакцин нового поколения.

На основе анализа дыхательной активности перитонеальных макрофагов, продукции γ-интерферона и титра полученных вируснейтрализующих антител впервые показано, что конъюгаты золотых наночастиц с вирусами обладают более высокой иммуностимулирующей активностью по сравнению с нативными вирусами. Полученные результаты важны для понимания механизмов адъювантных свойств наночастиц, используемых в качестве эффективного носителя антигенов при получении антител in vivo к слабо иммуногенным антигенам, и перспективны также в решении проблем создания антивирусных вакцин.

Отмечено, что развитые подходы к получению антител на туберкулин с использованием наночастиц золота позволяют нарабатывать in vivo специфичные антитела, которые могут быть применены в различных методах иммунодиагностики туберкулезной инфекции у человека и животных. Показано, что, проникая во внутриклеточное пространство, золотые наночастицы частично снимают токсический эффект, оказываемый туберкулином на перитонеальные макрофаги, что, по-видимому, способствует более активному развитию гуморальной реакции и выработке антител на туберкулин. Отсюда следует, что коллоидное золото можно, вероятно, применять как носитель для получения антител на вещества, обладающие токсическим эффектом. Эти данные создают, в частности, основу для создания туберкулиновой противотуберкулезной вакцины.

В опытах с иммунизацией животных гриппозным антигеном, конъюгированным с коллоидным золотом, выявлена выраженная стимуляция пролиферативной активности клеток селезенки, стимуляция выработки интерферона и активация образования антител. Это позволяет рассматривать коллоидное золото как эффективное иммуномодулирующее средство, которое может быть использовано для создания на его основе нового поколения химических вакцин.

Визуализация антигенов клеточной поверхности A. brasilense Sp245 конъюгатами коллоидного золота с миниантителами на ЛПС (А) и флагеллин (Б) в иммуноэлектронной микроскопииВизуализация антигенов клеточной поверхности A. brasilense Sp245 конъюгатами коллоидного золота с миниантителами на ЛПС (А) и флагеллин (Б) в иммуноэлектронной микроскопииМетод фагового дисплея использован для синтеза мини-антител на мембранные структуры опухолевых клеток (клетки линии СПЭВ – клеточной линии почек эмбриона свиньи с опухолевыми антигенами). Продемонстрирована пригодность конъюгатов антифаговых антител с золотыми нанооболочками для биоимиджинга клеток методом темнопольной микроскопии. С использованием фаговой библиотеки овцы были получены также мини-антитела против антигенов клеточной поверхности типового штамма A. brasilense Sp245, примененные для детектирования и исследования бактерий твердофазным и микроскопическими (электронная и конфокальная микроскопия) методами. В обоих случаях технология фагового дисплея успешно реализована в опытах с целыми клетками, редко используемыми для получения антител этим методом.

Подводя итог приведенному выше краткому перечислению полученных данных, можно констатировать, что значение результатов работ, посвященных развитию методологии иммунохимических, биохимических и микробиологических исследований, не ограничено только целями изучения растительно-микробных ассоциаций. Эти результаты могут быть использованы (и фактически используются различными исследовательскими коллективами у нас в стране и за рубежом) в более широком круге биологических и медицинских исследований.

Работы сотрудников лаборатории поддержаны грантами Президента РФ для ведущих научных школ, РФФИ, РНФ, Миннауки РФ, Президиумом РАН в рамках программ «Фундаментальные науки – медицине» и «Фундаментальные основы технологий наноструктур и наноматериалов», международным грантом Седьмой рамочной программы Евросоюза и др.

Сотрудники ЛИ выступают в качестве рецензентов работ, представляемых к публикации в российских и зарубежных научных изданиях. Вед. науч. сотр. д.б.н. Л.А. Дыкман включен в список победителей престижной международной премии Scopus Award Russia 2015 в совместной номинации с Федеральным агентством научных организаций, является членом редколлегии журнала ISRN Nanotechnology, выполнял работу эксперта по категории «Научно-техническая экспертиза и экспертиза образовательных проектов» корпорации «Роснано», назначен экспертом по приоритетному направлению «Индустрия наносистем» Федерального реестра экспертов научно-технической сферы (2012-2015 гг.), наряду с сотрудниками лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН он был отмечен в 2004 г. премией МАИК «Наука» за лучшую публикацию в издаваемых ею журналах. Старш. науч. сотр. д.б.н. С.А. Староверов является экспертом по приоритетному направлению «Биотехнология» Федерального реестра экспертов научно-технической сферы (2012-2015 гг.). Зав. лаб. С.Ю. Щеголев также зарегистрирован в Федеральном реестре экспертов научно-технической сферы (2013-2016 гг.).

За многолетний добросовестный труд на благо отечественной науки, практический вклад в обеспечение фундаментальных и прикладных научных исследований вед. науч. сотр. д.б.н. Л.Ю. Матора, вед. науч. сотр. д.б.н. Л.А. Дыкман и старш. науч. сотр. к.б.н. Н.В. Евсеева в 2010 г. награждены Почетной грамотой Президиума РАН и Центрального совета Профсоюза работников РАН. Науч. сотр. к.б.н. А.А. Широков в 2013 г. стал лауреатом молодежной премии им. П.А. Столыпина правительства Саратовской области за выдающиеся достижения в области науки. Зав. лаб. С.Ю. Щеголев в 2006 г. награжден медалью ордена «За заслуги перед Отечеством» II степени.


Основные публикации


Некоторые патенты
Авторизация
Обнаружили неточность?
Если Вы нашли ошибку в тексте – выделите её мышью и нажмите Ctrl+Enter