Лаборатория физиологии растительной клетки

Зав. лабораторией д.б.н. Олег Игоревич СоколовЗав. лабораторией д.б.н. Олег Игоревич СоколовОдним из основных научных направлений со времени основания Института остаются исследования в области физиологии и биохимии растений. Уже в 1981 году была организована лаборатория физиологии растений под руководством к.с-х.н. Мордкович Светланы Сергеевны. Основным направлением исследований было изучение азотного питания растений пшеницы в условиях Среднего Поволжья, в частности, динамики активности фермента нитратредуктазы в тканях и органах различных по устойчивости к климатическим условиям сортов пшеницы. В 1986 году на базе лаборатории физиологии растений была создана группа культуры тканей и клеток растений под руководством к.б.н. Березина Бориса Васильевича.

Исследовательская работа группы проводилась по двум направлениям:
– изучение процессов морфогенеза в культурах растений пшеницы in vitro;
– изучение взаимного влияния совместно культивируемых клеток пшеницы и штаммов Azospirillum на их физиологические и биохимические параметры.

В 1989 году на базе группы культуры тканей и клеток растений была организована лаборатория физиологии растительной клетки, руководителем которой стал к.б.н. О.И. Соколов. В течение пяти лет (1997-2001 гг.) д.б.н. О.И. Соколов успешно выполнял функции заместителя директора по НИР и международным связям.

Основным направлением исследований лаборатории стало изучение пространственно-временной организации и динамических изменений белков цитоскелета в зависимости от внешних факторов, включая и взаимодействие с почвенными микроорганизмами. Динамичная структура актиновой составляющей цитоскелета является структурно-интегрирующей основой жизнедеятельности растительной клетки, обеспечивает большой комплекс физиологических процессов в растительной клетке: движение цитоплазмы, верхушечный рост пыльцевой трубки, корневых волосков, полярную ориентацию внутриклеточных органелл, участие в сигнальной системе и т.д.

Сотрудники лаборатории (слева направо): к.б.н. Соколова М.К., Галицкая А.А., к.б.н. Селиванов Н.Ю., к.б.н. Селиванова О.Г., Орлов В.П., к.б.н. Ильчуков В.В.Сотрудники лаборатории (слева направо): к.б.н. Соколова М.К., Галицкая А.А., к.б.н. Селиванов Н.Ю., к.б.н. Селиванова О.Г., Орлов В.П., к.б.н. Ильчуков В.В.

В 2010 году к лаборатории присоединилась группа исследователей под руководством Селиванова Николая Юрьевича, основным научным направлением которой является изучение механизмов образования, рецепции и физиологической роли олигосахаридных фрагментов в растительных тканях. Олигосахаридные фрагменты обладают плейотропным действием на клетки организмов различного уровня организации, участвуя в регуляции важнейших процессов жизнедеятельности. Это позволяет рассматривать олигосахариды как универсальные экстраклеточные сигнальные регуляторы межклеточного и межорганизменного взаимодействия.

В настоящее время направления научно-исследовательской работы лаборатории следующие:
– отработка методов визуализации микрофиламентов актина и тубулина;
– выделение и идентификация актинов из различных тканей растений;
– изучение роли актина в формировании микрорельефа поверхности протопластов клеток растений;
– анализ состояния цитоскелета клеток растений в зависимости от факторов внешней среды.
– исследование параметров и характера ферментативной фрагментации пектиновых полимеров растений, определяющих образование олигосахаридов различной степени полимеризации.
– исследование влияния функциональных модификаций пектиновых полисахаридов на их биологическую активность.
– исследование влияния пектиновых олигосахаридов на биосинтез и состав поверхностных и экстраклеточных протеомов клеток растений и микроорганизмов.
– разработка эффективных меток и зондов для выявления и исследования рецепторов олигосахаридов в растительных клетках.

Основные результаты исследований
Для решения поставленных задач в лаборатории разработан метод выделения и очистки гладкомышечного актина из животных тканей и получения на его основе антиактиновых антител. Получены конъюгаты золей коллоидного золота различного размера с очищенной фракцией IgG к актину. Разработан метод получения маркера на основе низкомолекулярного ингибитора полимеризации актина фаллоидина и коллоидного золота. Показана возможность дифференциальной оценки количества филаментной и глобулярной форм актинов с использованием этих маркеров с чувствительностью 15-50 нг белка.

Выявление F-актина и хлорофилла в семядольных листьях Arabidopsis thaliana HeynhВыявление F-актина и хлорофилла в семядольных листьях Arabidopsis thaliana HeynhДля биохимического выделения растительного актина использовали предварительно обогащенные фракции цитозольных белков корней проростков пшеницы и эндокарпа плодов томата. Особое внимание было уделено защите от протеолиза. Из полученных фракций были выделены актиноподобные белки с разной степенью очистки. Иммунохимический анализ с помощью Western-блота показал различную картину выявляемых полипептидов в препаратах этих актинов, что, по-видимому, объясняется широкой вариабельностью генов актина у растений по сравнению с животными.

Электронно- и флуоресцентно-микроскопическая идентификация актина показала наличие в препаратах из различных тканей и органов растений как отдельных микрофиламентов, так и разветвленной сети пучков филаментов. Актиновая природа выявляемых филаментов подтверждается специфическим мечением маркером «фаллоидин-коллоидное золото» или флуоресцентным зондом – «фаллоидин-TRITC».

Визуализация F-актина в протопласте V. faba (фаллоидин-FITC)Количественную оценку распределения актина в субклеточных структурах проводили на препаратах тотальных, свободных и мембранносвязанных полисом из листьев конских бобов (Vicia faba L.). Впервые показана связь полисом с филаментной формой актинового цитоскелета.

С помощью сканирующей электронной микроскопии получены данные об особенностях структуры поверхности и субкортикального слоя протопластов, позволяющие судить о топографии субкортикального цитоскелета, его связи с процессами синтеза клеточной стенки. Для подготовки препаратов был использован модифицированный нами метод, не связанный с применением аппарата «критическая точка».

Микрорельеф поверхности протопластов клеток каллусной ткани моркови (Daucus carota Hoff.) характеризуется значительным количеством пор, похожих по топографии на «окаймленные» поры. Более длительная дегидратация препаратов позволила выявить протопласты с сетчатой поверхностью. Мы предполагаем, что в формировании подобной структуры участвуют элементы цитоскелета, в том числе и его актиновой составляющей. В частности, по данным просвечивающей электронной микроскопии, полученным при использовании фаллоидинового маркера, в субкортикальном матриксе протопластов выявляется относительно равномерная электронно-плотная сеть с большим количеством присутствующего в ней F-актина. Аналогичные данные получены при использовании в качестве объекта протопластов клеток листа табака (Nikotiana rustika L.).

Поверхность агрегата протопластов D. carota L. без дополнительной фиксации препаратов OsO4Поверхность агрегата протопластов D. carota L. без дополнительной фиксации препаратов OsO4В процессе получения препаратов актина из растительных тканей был обнаружен сопутствующий белок весом 56 kD. По ряду биохимических и иммунохимических параметров данный белок можно рассматривать как актин-ассоциированный белок. Методами флуоресцентной микроскопии на препаратах клеток листа и протопластов V. faba L. показана преимущественная локализация белка 56 kD совместно с F-актиновыми филаментами вокруг хлоропластов.

Топография внутренней поверхности вскрытого протопласта D. carota Hoff. Масштабная линейка 1,5 мкмТопография внутренней поверхности вскрытого протопласта D. carota Hoff. Масштабная линейка 1,5 мкмПоказано, что в процессе ферментативного гидролиза пектиновых полимеров деградация молекулы деэтерифицированного пектина протекает дискретно и детерминированно, что проявляется в образовании стабильного спектра олигосахаридов. Химическая модификация пектинового полисахарида имических (глюкозамин) сохраняет дискретность фрагментации молекулы полимера, но изменяет спектр образующихся олигосахаридных фрагментов.

Показана возможность направленного изменения активности и тканевой специфичности пектиновых олигосахаридов на основе модификации их структуры биоактивными лигандами.

Выявление белков на поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp245Выявление белков на поверхности клеток Azospirillum brasilense Sp245Разработан оригинальный метод получения препаратов белков поверхности и клеточной стенки растительных клеток. Выявлена способность пектиновых поли- и олигосахаридов стимулировать процессы морфогенеза и изменять спектр белков поверхности у клеток суспензионной культуры A. thaliana, а также некоторых штаммов бактерий рода Azospirillum.

В настоящее время в лаборатории работают н.с. к.б.н. В.В. Ильчуков, с.н.с. к.б.н. Н.Ю. Селиванов, н.с. к.б.н. О.Г. Селиванова, н.с. к.б.н. М.К. Соколова, м.н.с. В.П. Орлов, вед. инж. А.А. Галицкая, вед. инж. Т.С. Наумова.

Агрегация клеток суспензионной культуры A. thaliana под воздействием пектиновых олигосахаридовАгрегация клеток суспензионной культуры A. thaliana под воздействием пектиновых олигосахаридовЗа период работы сотрудниками опубликовано более 70 статей в российских и международных изданиях. Материалы исследований были представлены в виде докладов и стендовых сообщений на многих международных и российских симпозиумах, посвященных проблемам физиологии и биохимии растений и микроорганизмов.

В лаборатории поддерживаются патенты:
– патент на изобретение №2009107982 Российская Федерация. Способ получения аксеничной культуры высших водных растений / Галицкая А.А., Селиванова О.Г., Селиванов Н.Ю. В.В. Игнатов. Приоритет от 06.03. 2009 г.
– патент на изобретение РФ № 2410395 от 27.01.2011, бюл. № 3 «Способ получения моноспецифических антител к белкам растительных клеток», Авторы: Фадеева И.Ю., Евсеева Н.В., Селиванов Н.Ю., Щеголев С.Ю.

Сотрудниками лаборатории защищены 5 кандидатских и одна докторская диссертации.

Научно-исследовательская деятельность лаборатории поддерживается грантами РФФИ, Президента РФ и др. Ряд исследований проводится в рамках договоров о научном сотрудничестве с другими научными организациями.

В течение всего срока существования лаборатория проводит также научно-сервисную работу для подразделений института, а также для других научно-учебных организаций: просвечивающая и сканирующая электронная, флуоресцентная и конфокальная микроскопии, разделение и анализ белков и других метаболитов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, седиментационное фракционирование и анализ биополимеров.

Основные публикации
Авторизация
Обнаружили неточность?
Если Вы нашли ошибку в тексте – выделите её мышью и нажмите Ctrl+Enter